因果反转？研究表明淀粉样蛋白沉积或是阿尔茨海默症发展“驱动者”

近日，Cell 上的一篇关于阿尔茨海默症 (AD) 病因的研究，“颠覆”了“淀粉样蛋白沉积”作为疾病结果的观点。比利时佛拉姆斯生物技术研究所 (VIB) 和鲁汶大学的 Bart De Strooper 教授以及 Mark Fiers 研究团队利用空间转录组法对斑块进行研究，并指出淀粉样蛋白沉积不仅仅是疾病的产物，也可能是推动疾病发展的原因。

近日，Cell 在线发表的论文 “Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer’s Disease” 中，研究团队在 AD 小鼠模型中，利用空间转录组学研究淀粉样斑块周围直径 100 μm 的组织结构域的转录变化，证明了丰富的髓鞘和少突胶质细胞基因 (OLIGs) 的基因共表达网络的早期改变，而斑块诱导基因 (PIGs) 的多细胞基因共表达网络涉及补体系统、氧化应激、溶酶体和炎症，在疾病的后期表现突出。研究人员通过对小鼠和人脑切片的原位测序，证实了细胞水平上观察到的大部分变化。全基因组空间转录组分析提供了一个新的方法，以揭示 AD (淀粉样蛋白沉积) 和其他脑疾病的致病标志物周围的细胞网络失调。

研究背景

淀粉样斑块与神经变性过程的关系是 AD 研究中的一个核心问题。自从“淀粉样蛋白沉积”的病理现象被发现后，一个世纪以来，科学界展开了大量的研究，直到现在这种现象与 AD 疾病发展之间的关系仍未明了。已知：

1、淀粉样斑块可能起 AD 的触发或驱动作用。

2、散发性 AD 的风险与小胶质细胞中响应淀粉样蛋白沉积的基因表达相关，星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞也表现出对淀粉样斑块的分子反应。

3、在 AD 中，将神经元、各种神经胶质细胞分离再检测胞质 mRNA 结果并不理想，还可能人为的影响表达图谱，导致大多数空间信息的丢失，包括细胞和淀粉样斑块的关系。空间条形码阵列 (Spatially barcoded arrays) 支持进行组织中无偏倚的转录组分析，维持已测序分子的空间定位。

Bart De Strooper 和 Mark Fiers 研究团队通过一种开创性技术来具体研究斑块附近的脑细胞中发生的变化。

图 1. 研究概要图

文章概要

在小鼠和人脑样本中，该研究结合空间转录组法和原位测序的实验方法，显示了 AD 中的多细胞基因共表达网络。研究团队鉴定了两个由淀粉样斑块沉积诱导表达网络，一个是斑块诱导基因 (PIG) 网络，主要涉及小胶质细胞和星形胶质细胞；另一个是少突胶质细胞基因 (OLIG) 和髓鞘反应。

主要研究方法

空间转录组方法 (ST)

正交原位测序方法 (ISS)

RNAscope 原位杂交技术

免疫荧光检测技术

小鼠模型

App^NL-G-F小鼠 (AD 小鼠模型，App gene：淀粉样前蛋白基因)

C57BL/6 小鼠研究结果

研究团队对 AD 小鼠的 10,327 个组织域 (TD) 空间转录组 (ST) 图谱根据大脑区域进行聚类，并通过 WGCNA (基因共表达网络分析，基于具有相似表达模式的基因可能具有相似的功能) 划分模块。作者重点介绍了对 β-淀粉样蛋白 (Aβ) 高度敏感的两个 WGCNA 模块：PIGs 和 OLIGs。

图 2. Gene Ontology 分析和 WGCNA 分析

(purple: PIGs; red: OLIGs)

■ PIG 模块

斑块诱导基因 (Plaque-induced gene, PIG) 主要在星形胶质细胞和小胶质细胞中表达，体现了它们之间的细胞间串扰，并涉及其他细胞。这种相互作用使经典补体系统和内体/溶酶体途径伴随着改变。

为了了解基因表达的变化，研究人员进行了两次差异表达分析。第一次比较 App^NL-G-F 小鼠与 C57BL/6 小鼠 (基因型模型，基因型轴)，第二个研究 Aβ 沉积对基因表达的影响 (Aβ 模型，Aβ 轴) 。
在 App 敲入的 AD 小鼠模型中，淀粉样蛋白斑块微环境中逐步建立一种多细胞共同表达的基因反应。其中包括 57 个 PIGs，在 Aβ 轴和基因型轴在晚期 (18 个月大小鼠) 反应最为活跃，这些基因在早期 (3 个月) 只是轻微上调，经历一个急剧上升到晚期稳定的过程。因此，PIG 的表达随着在整个脑区域中 Aβ 的积累而逐渐增加。
该模块中涉及了经典补体级联 (如 C1qa，C1qb，C1qc 等)，还有补体级联所触发的效应机制，如内吞作用 (如 Fcer1g，Fcgr3，B2m 等)，溶酶体降解 (如 Hexa，Hexb，Ctsa  等) ，抗原加工提呈、免疫应答和氧化还原过程。此外，PIG 模块的细胞标志与激活的小胶质细胞和炎性星形胶质细胞有很高的重叠性。
图 3. PIG 与 ARM/DAM 小胶质细胞和星形胶质细胞部分重叠 (DAM：疾病相关的小胶质细胞；ARM：激活反应的小胶质细胞)

其他实验补充：ST 结果显示了淀粉样斑块周围有多细胞反应，但 ST 技术无法达到单细胞水平，因此研究团队还通过 ISS 在单细胞水平上作为对实验进行补充，ISS 的结果与 ST 的结果具有很好的相关性。PIG 网络的细胞标志显示，PIG 对 Aβ 的反应在很大程度上是由小胶质细胞引起的，在较小程度上由星形胶质细胞引起的。利用 RNAscope 原位杂交验证了补体组分 (C1qa，C4 和 Clu) 在晚期 AD 小鼠模型中的表达，这 3 个补体组分的细胞标志与 ISS 分析一致。

图 4. 随着 Aβ 沉积逐步建立的 PIGs 的共表达网络

PIGs 中小胶质细胞和星型胶质细胞基因的共表达：根据 Aβ 沉积水平将所有 ST TD 分为 WT 和 AD 的四个等级，WGCNA 生成一个指示基因之间相关性的共表达通用矩阵，随着 Aβ 积累的增加，基因联系的“剂量”敏感性 (Dose-sensitive) 增加，显示了表达网络随着 Aβ 暴露的增加而逐步建立。

■ OLIG 模块

少突细胞基因 (oligodendrocyte gene, OLIG) 为髓鞘化相关基因，主要由少突胶质细胞表达。

WGCNA 第二个大的模块由主要由少突胶质细胞表达的 165 个基因组成，被称为 “OLIG 模块”。实验证明，OLIG 模块在中度 Aβ 暴露时高表达，但是在重度 Aβ 暴露的微环境中下降。因此，OLIG 模块表达的大脑区域差异与 Aβ 表达程度相关。

图 5. OLIG 模块对 Aβ 积累的响应
(Oli0：人类 AD 相关的少突胶质细胞标记物的小鼠直系同源物)

总的来说，该研究证实了 OLIGs 的基因共表达网络在疾病早期改变，而 PIGs 的多细胞基因共表达网络涉及补体系统、氧化应激、溶酶体和炎症，在疾病的后期表现突出。

■ 人脑中 PIG 和 OLIG 模块的可视化

研究人员对 AD 患者额上回组织样本的 222 个基因表达谱进行分析，包括 PIGs 的 45 个人类同源序列表达，OLIG 模块中 42 个斑块反应性基因同源序列的表达，以及一系列的细胞类型标志，如预期一样，PIG 模块和 OLIG 模块基因分别在灰质和白质中富集。使用同样的 ISS 方法研究了 PIGs 在对照和 AD 脑中人类直系同源物的分布，证明了 AD 患者中与疾病相关的神经胶质活化。

图 6. 人脑中 PIG 和 OLIG 模块的分析

结论：
实验技术：展示了最近开发的 ST 和 ISS 技术在脑疾病方面的应用。实验结果：数据表明，淀粉样斑块在疾病发展中“并非无辜”，实际上，它诱导了周围所有细胞的强烈和协调的反应。因此，还需要进一步的工作来了解是否以及何时去除淀粉样蛋白斑块足以逆转正在进行的细胞过程。另外，抗体结合淀粉样斑块将调节这些胶质反应有待确定，这会使临床试验的结果的解释复杂化，因为细胞效应可能因抗体而异。小编速报：近日，阿尔茨海默症新药 β 淀粉样蛋白抗体 Aducanumab 获美国 FDA 优先审评资格。

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缩写：

AD：Alzheimer’s diseaseOLIGs ：Oligodendrocyte genesPIGs：Plaque-induced genes
Aβ：Amyloid β-proteinST ：Spatial transcriptomics
TDs ：Tissue domains
App：Amyloid precursor proteinENTI：Entorhinal area
ISS ：In situ sequencing
DAM ：Disease-associated microglia
ARM：Activated response microglia

原文阅读：Wei-Ting Chen, et al. Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer's Disease. Cell. 2020 Jul 17;S0092-8674(20)30815-1.
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